己烯雌酚快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物己烯雌酚的含量。
二、試劑盒特性
u試劑盒靈敏度： 0.1ppb
u 孵育溫度： 37℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
u 樣本檢測下限
組織（蝦、魚） ······························· 0.2 ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 ······························· 2 ppb
肌肉組織(方法二) ··························· 0.1 ppb
飼 料 ············································ 20ppb
尿 液 ··········································· 0.6ppb
u 交叉反應率
己烯雌酚 ········································ 100%
雙烯雌酚 ········································ 38.5%
己烷雌酚 ········································ 8.5%
己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%
雌三醇 ········································· ﹤0.1%
u樣本回收率
飼 料 ·········································· 90±10%
組 織 ·········································· 85±10%
尿 液 ·········································· 70±10%
三、試劑盒組成
1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條
標準液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb
3 酶標記物 12ml 紅色帽
4 抗體工作液 7ml 藍色帽
5 底物 A 液 7ml 白色帽
6 底物 B 液 7ml 黑色帽
7 終止液 7ml 黃色帽
8 20X 濃縮洗滌液 40ml 白色帽
9 5X 濃縮復溶液 50ml 透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、
多道 30～300 µl
試 劑：乙腈、*、氯仿、丙酮、濃磷
酸（含量 85%）、乙酸乙酯
五、樣本前處理步驟
u樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
u 樣本前處理需配制：
配液 1 6M H3PO4 溶液
100ml 濃 H3PO4（含量 85%）加去離子
水 150ml 混合均勻。
配液 2 2M NaOH 溶液
8gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。
配液 3 1M NaOH 溶液
4gNaOH 加去離子水 100ml 溶解。
配液 4 乙腈-丙酮混合液
V 乙腈-V 丙酮 = 4 : 1
配液 5 樣本復溶液：
將5X 濃縮復溶液用去離子水 1：4 稀釋。
u樣本處理：
（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法
1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 6ml 乙腈-丙
酮混合液，震蕩 2min，15℃，4000r/min 以上，離心 10min。
2、取 3ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干。
3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 2M NaOH，
渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min。
4、取 1ml 上清液，加入 200µl 6M H3PO4，渦動 5s。5、加入 3ml 乙腈萃取，振蕩 2min，室溫 4000r/min
以上，離心 10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。
6、用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻
30s。
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 蝦魚：直接取 50µl 水相用于檢測。
2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取 50µl 水相加入 450µl 樣
本復溶液，渦動混合 30s；取 50µl 用于檢測。
樣本的稀釋倍數：蝦魚稀釋倍數：2
豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數：20
（b）肌肉組織處理方法二
1、稱取 2±0.05g 勻漿后的樣本，加入 2ml 2M
NaOH 溶液，震蕩 2min；2、加入 8ml 乙酸乙酯，劇烈震蕩 5min ；
3、 15℃，4000r/min 以上，離心 10min；
4、取 4ml 上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干；
5、用 1ml 樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻
30s。
樣本稀釋倍數：1
（c）飼料處理方法
1、稱取 2±0.05g 搗粹后的飼料樣本，加入 8ml 乙
腈，振搖 2min，15℃ 4000r/min 以上離心 10min；2、取 2ml 上清液，60℃氮氣/空氣吹干；
3、加入 0.5ml 氯仿，渦動 20s，加入 2ml 1M NaOH，
渦動 30s，4000r/min 以上，離心 5min；4、取 1ml 上清液，加入 100µl 6M H3PO4，渦動 5s；
不同樣本按如下方法稀釋：
1、 配合料：取 50µl，加入 950µl 樣本復溶液，渦
動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。
2、 濃縮料/預混料：取 25µl，加入 975µl 樣本復溶液，渦動混勻 30s，取 50µl 用于檢測。
樣本稀釋倍數：
配合料稀釋倍數：100
濃縮料、預混料稀釋倍數：200
（d） 尿樣樣本處理方法
1、取 2ml 尿液到離心管中，室溫 4000r/min 以上，
離心 10min，直至清亮；2、移取 1ml 清亮尿液至離心管中，加入 1ml 1M
NaOH 強烈振蕩 5min；3、加入 100µl 6M H3PO4，渦動 30 s；
4、再加入 8ml 氯仿進行萃取，振蕩 5min。15℃，
4000r/min 以上離心 10min；
5、去掉上層的水相，取下層有機相 4 ml，60℃氮
氣/空氣吹干；6、用 3ml 樣本復溶液干燥的殘留物，混合 30s 7、取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數：6
六、酶標免疫分析程序:
u測定前應須知：
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫
（20～25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。
3、 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定程序中的要點。
4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
u操作步驟：
1、從 2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～
25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放
入自封袋，保存于 2-8℃。
3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環境中反應 30min。
6、將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
7、每孔加入酶標記物 100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應 30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色 15min。
9、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n m 檢測，5min 內讀數），測定每孔 OD 值。
七、結果判定
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負相關。
1、粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本 1 的吸光度值為 0.3，樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是：
0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415； 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。
則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 2、保 質 期：該產品有效期為 1 年，生產日期見
吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 包裝盒。
孔）除以第一個標準（0 標準）的吸光度值，再乘 提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正
以 100%，即 常有效，不影響實驗結果，請放心使用。
B
百分吸光率（%）＝ ×100%
B0
B
—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以己烯雌酚標
準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數 即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
八、 注意事項
1、室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會導致所有標準的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。
4、反應終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質。
8、該試劑盒最佳反應溫度為 37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
九、儲藏條件和保質期
1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
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